تهیه ی نمونه برای جداسازی ویروس:

نمونه ها که از بیمار تهیه می شود لازم است در زمان مناسب و سریع به آزمایشگاه انتقال یافته و کارآماده سازی و تلقیح آن به میزبان مناسب (کش سلول ، تخم مرغ جنین دار، حیوان آزمایشگاهی) نیز به سرعت انجام پذیرد. نمونه مدفوع را باید در روی دستگاه مخلوط کنند. نمونه های بافت را با قیچی ابتدا خرد کرده و با دستگاه مخصوص شیرابه یکنواختی از آن تهیه کرد. قبل از تلقیح لازم است نمونه را فیلتر کرد تا باکتری ها و قارچ های آلوده کننده حذف شوند.

 

روش تخم مرغ جنین دار:

در پوسته خارجی تخم مرغ جنین‌دار سوراخی تعبیه کرده و از آن راه سوسپانسیون ویروس را در مایعات تخم مرغ تزریق می‌کنند. در تخم مرغ چندین غشا وجود دارد که می‌توان بر روی آنها ویروسها را پرورش داد. رشد ویروس را از روی مرگ جنین یا آسیب دیدن سلولهای جنینی می‌توان مشاهده کرد. این روش امروزه برای پرورش ویروسها به منظور تهیه واکسن بکار برده می‌شود

 

روش کشت سلولی:

استفاده از تکنیکهای کشت سلولی موجب شده است که شناسایی و کشت ویروسهای ایزوله شده جدید و خصوصیات ویروسهای شناخته شده قبلی آسان شود. سه نوع کشت سلولی وجود دارد. کشتهای سلولی اولیه که می‌توان با پراکنده نمودن سلولهایی از نمونه‌های بافتی که به تازگی تهیه شده‌اند با آنزیم تریپسین فراهم نمود.

این سلولها بعد از چند بار کشت قادر به رشد نیستند، و کشتهای سلولی ثانویه و کشت سلولی مداوم که به تعداد نامحدود رشد می‌کنند. نوع کشت سلولی مورد استفاده در کشت ویروس به حساسیت سلولها نسبت به ویروس مورد نظر بستگی دارد.

تکثیر ویروس در کشت یاخته :

انتخاب نوع یاخته به نوع ویروس تحت مطالعه بستگی دارد. اگر نمونه به درستی تهیه شده باشد و یاخته های حساس نیز به کار گرفته شوند می توان انتظار اشت که ویروس هایی که احتمالاً در نمونه وجود دارند در یاخته تکثیر پیدا کنند.

یاخته های شاهد باید مورد بررسی قرار گیرند چون اگر کشت یاخته ها را بیش از یک هفته نگهداریم ممکن است در یاخته های آلوده نیز تغییراتی شبیه CPE ایجاد شوند. با دیدن CPE ، بررسی اطلاعات مربوط به علائم بیماری و نوع نمونه ارسال شده به آزمایشگاه می توان اقدام به تشخیص مقدماتی ویروس کرد اما اگر CPE مشاهده نشود و یا در مورد آن شک وجود داشته باشد باید پاساژ دوم و یا سوم (پاساژکور) نیز انجام شود.

تکثیر ویروس در حیوانات آزمایشگاهی :

از گونه های حیوانی به ویژه آنها که فاقد آنتی بادی اختصاصی هستند می توان برای جداکردن ویروس هایی که قابل کشت نیستند استفاده کرد مثلاً تزریق داخل آمنیون جنین مرغ حساس ترین روش برای جدا کردن ویروس های آنفلوآنزا و تعدادی از ویروس های طیور است.

 

4- تشخیص آنتی بادی ضد ویروسی:

با بررسی وجود IgM در خون انسان ها و بادام ها می توان به وجود بیماری پی برد، با توجه به این که آنتی بادی در اوایل عفونت اولیه ایجاد شده بنابراین وجود آن دلیل بر عفونت تازه است. چون IgM نمی تواند از جفت انسان عبور کند وجود آن در خون نوزاد دلیل بر آلودگی داخل رحمی است.

برای بررسی وجود آنتی بادی های سرم و اندازه گیری آنها روش های گوناگونی وجود دارد :

روش الیزا :

به آن ارزیابی ایمنی با آنزیم (EIA) نیز گفته می شود که روشی بسیار حساس بوده و برای نشان دادن آنتی بادی های ضد ویروسی نیز به کار می رود. دارای روش های گوناگون است که اساس همه آنها اتصال به یک سطح سفت است. برای افزایش حساسیت این روش می توان از قدرت اتصال بالای آویدین برای بیوتین سود جست

سنجش ایمنی با استفاده از مواد رادیو اکتیو (RIA) :

به روش مستقیم و یا روش غیرمستقیم انجام می گیرد که در روش مستقیم نمونه را به آنتی بادی اختصاصی متصل شده به پلیت اضافه نموده و پس از شستشو، آنتی بادی اختصاصی نشان دار شده با ماده رادیو اکتیو را به مجموعه آنتی ژن – آنتی بادی اضافه نموده و پس از انکوباسیون و شستشو در دستگاه مخصوص نتایج را می خوانند و در روش غیر مستقیم آنتی بادی اختصاصی را به پلیت متصل نموده و نمونه را به آن اضافه کرده و آنتی بادی اختصاصی را می افزاییم که در نهایت به مجموع فوق آنتی بادی نشاندار اختصاصی ضد آنتی بادی را اضافه و نتیجه را در دستگاه می خوانیم .

خنثی کردن ویروس به توسط سرم :

در این روش ابتدا سرم حاوی آنتی بادی های خنثی کننده ویروس را به مدت نیم ساعت درحمام ماری ° 56(سانتی گراد) حرارت داده سپس مقادیر مساوی از ویروس و سرم را مخلوط کرده و بعد از انکوباسیون به یاخته های حساس اضافه و درانکوباتور قرار می دهند. اگر در سرم آنتی بادی های اختصاصی ویروس وجود داشته باشد عفونت زایی ویروس خنثی شده و CPE ایجاد نمی شود

پیشگیری از هماگلوتیناسیون :

اگر آنتی بادی اختصاصی و ویروس را مخلوط کرده و سپس به گلبول های قرمز اضافه کنیم هماگلوتیناسیون انجام نخواهد شد.

ایمونو فلورسانس:

این روش به علت حساسیت، سرعت، سادگی نسبی اهمیت خاصی به خصوص در مورد بیماری هاری دارد. دو روش رنگ آمیزی وجود دارد :

1 - مستقیم که در آن آنتی بادی ضد ویروس را با رنگ فلورسنت نشاندار کرده و پس از شستشو نتیجه را در میکروسکوپ دارای اشعه ماوراء بنفش مشاهده می کنند.

2 – غیرمستقیم (ساندویچ) که در آن ایمونوگلوبولین ضد آنتی بادی اختصاصی را با رنگ فلورسنت نشاندار می کنند.

ضد آنتی بادی اختصاصی به کار رفته IgG است.

رنگ آمیزی با پراکسید آز :

این روش مشابه ایمونوفلورسنس است اما به میکروسکوپ مخصوص نیاز ندارد که در آن آنتی بادی نشان دار شده با آنزیم را به آنتی ژن تحت آزمایش اضافه کرده سپس سوبسترای مناسب آنزیم را به مجموعه فوق اضافه می کنیم وقتی آنزیم پراکسید از مصرف می شود، سوبسترا عبارت است از H2o2 که با یک مشتق بنزیدین مخلوط شده تا در حضور این آنزیم تشکیل یک رسوب رنگی را بدهد.

وسترن بلاتینگ :

در این روش ویروس را تخریب نموده، پروتئین های آن را با استفاده ازالکتروفورزدرژل پلی آکویل آمید جدا ساخته، بر روی پرده نیترو سلولوز انتقال داده ، آنتی سرم را به آن اضافه می کنیم، آنتی بادی ضد IgG که نشان دار است را به آن افزوده و نتیجه را با الیزا می خوانیم.

4-تشخیص دادن اسید نوکلئیک ویروسی :

به غیر از روش های معمول که برای جدا کردن ویروس ها و یا نشان دادن آنتی ژن آنها به کار می رود راههای سریع دیگری برای تشخیص بیماری با نشان دادن اسید نوکلئیک ویروسی وجود دارد که در این کار از اسید نوکلئیک نشاندار شده به عنوان الگو استفاده کرده و اسید نوکلئیک ویروسی را با آن جفت می کنند. اساس جفت نمودن این است که DNA یک رشته ای، با پیوند هیدروژنی بین بازهای جفت با رشته مکمل DNA یا RNA جفت می شود برای این کار DNA را حرارت داده تا دو رشته آن جدا شوند پس از سرد شدن RNA و یا DNA، الگو را به آن اضافه می کنند تاعمل جفت شدن انجام شود.برای جفت نمودن اسید نوکلئیک راه های گوناگونی وجود دارد:

جفت نمودن بر روی اسید نوکلئیک ثابت شده (DBH) :

با جوشاندن اسید نوکلئیک استخراج شده از ویروس و یا از یاخته آلوده دو رشته آن را هم جدا نموده وآن را به صورت لکه ای بر روی پرده فیلتر نایلون باردار شده و یا نیترو سلولز قرار داده تا به آن متصل نمود. سپس DNA یا RNA یک رشته ای الگو را که با ماده رادیو اکتیو نشان دار شده به اسید نوکلئیک تحت آزمایش اضافه کرده و آن را شستشو می دهند تا الگوهای متصل نشده زایل شوند. علائم ایجاد شده توسط الگوی متصل شده را با اتو رادیوگرافی اندازه می گیرند.

 جفت نمودن با روش ساترن بلات:

DNA را با استفاده از اندونوکلئازهای محدود به الیگونوکلئوئیدهای کوتاه تر تقسیم کرده و با استفاده از الکتروفورز بر روی ژل آگازر یا ژل آکریل آمید آنها را از هم جدا می کنند و با مواد قلیایی دناتوره می کنند سپس DNA های جدا شده را بر روی پرده های فیلتر نایلون و یا نیتروسلولز انتقال داده و با پراب های نشاندار شده جفت کرده و مورد بررسی قرار می دهند.

واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) :

در باید دو الیگونوکلئوتید کوتاه را به زنجیرهای DNA موجود در دو طرف منطقه مورد نظر، هر کدام برای یکی از دو رشته DNA جفت نمود. تکثیر به روش PCR از آنزیم DNA پلی مراز شماره یک که از باکتری ترموس – آکواتیکوس گرفته شد و در برابر حرارت مقاوم است استفاده می شود.

روش PCR سه مرحله دارد :

1. ذوب کردن دو رشته DNA ویروس تحت آزمایش

2. متصل کردن الیگونوکلئوتیدهای پریر که بتوانند با نوکلئوتیدهای موجود در زنجیرهای مجاور محلی که باید تکثیر شود پیوند تشکیل دهند.

3 . تکثیر DNA که با امتداد دادن پریمرها توسط آنزیم TAP پلی مراز انجام می شود.

با توجه به مقاومت Tap در برابر حرارت دوره ذوب کردن و جفت نمودن را می توان 30-25 بار تکرار کرده و صدها میلیون کپی از قطعات DNA تکثیر شده تولید کرد.

 

ماشين‌هاي گشت‌زني:

ساخت ماشين‌هاي گشت‌زني در بدن براي تشخيص سلول‌هاي مهاجم، هميشه از رؤياهاي مورد علاقه فعالان فناوري‌نانو بوده است، و وسيله‌اي از يك تك مولكول كه توسط تيم تحقيقاتي دانشگاه اورشليم ساخته شده به طور چشمگيري شبيه اين نوع ماشين‌ها مي‌باشد. اين مولكول‌ها هنگام شناخت يك پاتو‍ژن نورافشاني مي‌كنند.

آنها يك ماشين DNA ساختند كه با شناخت ژنوم ويروس‌ها، آنها را شناسايي كرده و يك سيگنال اعلام خطر درخشان قابل رؤيت، توليد كند. اما هنوز اين ماشين با نانوروبات‌هايي كه توانايي از بين بردن ويروس‌ها را دارند فاصله زيادي دارند. دليل اين امر اين است كه براي داشتن چنين نانوروبات‌هايي احتياج به استفاده از مواد شيميايي است. البته در اين جا نيز هدف، ساخت ربات مولكولي نبوده بلكه ايجاد روشي جديد براي شناسايي ويروس‌ها مي‌باشد.


Itamar willner و همكارانش ادعا كردند ابزاري از DNA ساخته‌اند كه مي‌تواند در عرض يك و نيم ساعت ويروس مورد نظر را شناسايي كند. در حالي كه روش‌هاي كنوني مبتني بر DNA براي شناسايي ويروس‌ها يا باكتري‌ها احتياج به مراحل شيميايي پيچيده‌اي دارند.


به گفته Chengde mao متخصص DNA و فناوري‌نانو در دانشگاه Purdue: "اين يك روش بسيار حساس مي‌باشد"
willner و همكارانش از توانايي‌هاي DNA هم به عنوان يك منبع اطلاعات ژنتيكي و هم يك كاتاليست شبه آنزيمي كه واكنش‌هاي شيميايي را تسريع مي‌كند استفاده نمودند.

ماشين مولكولي آنها يك تك زنجيره DNA مي‌باشد كه شامل سه قمست است. قسمت اول (بخش A) DNA ويروسي را تشخيص مي‌دهد و قسمت ديگر (بخش C) حاوي ساختارهاي لازم براي ساخت مولكول‌هاي كاتاليستي DNA يا همان DNAzyme مي‌باشد و اما قسمت سوم (بخش B) جايي است كه آنزيم به آن چسبيده و DNAzyme از بقيه مولكول آزاد مي‌شود.
يك مولكول مجزاي DNA، hairpin ناميده مي‌شود و دليل آن هم اين است كه دو سر انتهايي آن مانند يك حلقه به هم مي‌چسبند و از يك سمت به يك پاتوژن DNA و از سمت ديگر به قسمت A ماشين طراحي شده مي‌چسبد. اين ماشين‌ آنزيم‌ها را در محلول به منظور ساختن DNAzyme هاي كد شده در بخش C فعال كرده و سپس آن را قطع و رها مي‌كند.
مولكول معروف به hemin، DNAzymeهايي را كه از مولكول ديگري به نام luminol انتقال يافته فعال كرد و باعث مي‌شود نور تابش كند